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猪小肠微生物培养基和接种物的制备

日期:2018/1/30 16:19:31 点击次数 2361 发布单位:天义生物谷  录入:李清

    摘要:以成年猪的十二指肠、空肠和回肠内容物为接种物,以豆粕、菜粕或鱼粉水解物上清液为氮源底物,于发酵的 0、4、8、 12 h 分别测定发酵液 pH、微生物蛋白、氨氮和挥发性脂肪酸含量,同时提取细菌 DNA 并进行定量分析。

    选用 3 种常用蛋白质原料,即豆粕(CP%=49.3%)、菜粕(CP%=40.9%)和鱼粉(CP%=67.2%)。为了模拟饲料在猪体内的消化过程,参照 Huang 等体外两步酶解法对蛋白质原料进行消化处理。每瓶原料含氮量为 100 mg,每种原料 16 瓶,各加入 9 mL 蒸馏水振荡混匀,依次添加 α-淀粉酶(Sigma 公司)、胃蛋白酶(Solarbio 公司)、胰蛋白酶(Solarbio 公司)和糜蛋白酶(Solarbio 公司)模拟胃、小肠两阶段消化。将消化液转移到透析袋置于 0.01 mol/L 氯化钠溶液,37 °C 透析 15 h;后更换透析液,继续透析 2 h。最后用尼龙网过滤收集每种原料的全部酶解液,用于配制培养基。

    参照 Dai 等方法配制厌氧培养基。加入过量葡萄糖(10 mg/L),氮源为唯一变量条件,含氮培养基添加制备的全部消化滤液,调节培养基pH为6.8。厌氧条件下分装 83 mL 至血清瓶,含氮培养基每瓶含氮量为 100 mg,115 °C 灭菌 15 min。

    收集 4 头(杜×长×大)商品猪(饲喂玉米-豆粕日粮)的新鲜十二指肠、空肠中段和回肠中段食糜,根据马梅蕾等方法制备接种物,厌氧条件下用 37 °C 无氮培养基稀释食糜,培养基与食糜的稀释比例分别为十二指肠 3:1 (V/W)、空肠和回肠 9∶1 (V/W)。将混合液经 4 层无菌纱布过滤至血清瓶,静置培养 4 h。然后分别取接种物 5 mL,接种至上述培养基中,发酵体系为 90 mL,静置培养 12 h。

    试验包括 S (Soybean meal,豆粕组)、R (Rapeseed meal,菜粕组)、F (Fish meal,鱼粉)和 N (No nitrogen,无氮组) 4 种培养基,分别接种由十二指肠、空肠或回肠食糜制备的接种物,共 12 组,每组 4 个重复。接种后将发酵瓶置于 37 °C 条件下持续培养 12 h。

    分别于 0、4、8、12 h 采集培养液样品各 5 mL,参照马艳艳等方法用 pH-HJ90B 酸度计测定 pH;参照 Weatherburn 等方法测定氨氮浓度;参照 Makkar 等方法测定菌体蛋白含量;参照 Mao 等方法用气相色谱仪(Shimadzu,GC-14B,Japan) 测定乙酸、丙酸和丁酸浓度;参照 Yang 等方法用酚/氯仿/异戊醇抽提若干次获得发酵液总 DNA,参照 Yang 等方法测定总细菌、拟杆菌门、厚壁菌门和乳酸杆菌数量。

    试验数据经 Excel 2013 初步处理后,利用 SPSS 17.0 进行单因素方差分析,差异显著性采用 LSD-Turkey 法进行多重比较,P<0.05 时为差异显著。

 
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