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食品中金黄色葡萄球菌的检验方法

日期:2018/11/25 15:09:47 点击次数 876 发布单位:天义生物谷  录入:李清

一、设备和材料


1、冰箱:0℃~4℃。


2、恒温培养箱:36℃士1℃。


3、显微镜:10*——100*。


4、均质器或灭菌乳钵。


5、架盘药物天平:0g——500g,精确至0.5g。


6、灭菌试管:10mm*100mm、16mm*160mm。


7、灭菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。


8、灭菌锥形瓶:500mL、100mL。


9、灭菌培养皿:直径90mm。


10、注射器:0.5mL。


11、灭菌L型涂布棒。


12、灭菌刀、剪子、镊子等。


二、培养基和试剂


1、胰酪脏大豆肉汤:按GB/T4789.28一2003中4.59规定。


2、 7.5%氯化钠肉汤:按GB/T4789.28一2003中4.61规定。


3、血琼脂平板:按GB/T4789.28一2003中4.6规定。


4、 Baird一Parker琼脂平板:按GB/T4789.28一2003中4.60规定。


5、肉浸液肉汤:按GB/T4789.28一2003中4.1规定。


6、 0.85%灭菌生理盐水。4.7兔血浆:按GB/T4789.28一2003中4.63规定。


三、操作步骤


1、增菌培养法


(1)检样处理:按无菌操作取检样25g(ml),加入225mL灭菌生理盐水,固体样品研磨或置均质器中制成混悬液。


(2)增菌及分离培养:吸取5ml上述混悬液,接种于7.5%氯化钠肉汤或胰酪陈大豆肉汤50mL培养基内,36℃士1℃培养24h,转种血平板和Baird一Parker平板,36℃士1℃培养24h,挑取血平板上金黄色(有时为白色)菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。


(3)形态:本菌为革兰氏阳性球菌,排列呈葡萄球状,无芽胞,无荚膜,致病性葡萄球菌菌体较小,直径约为0.5um~1um。


(4)在肉汤中呈混浊生长,在胰酩膝大豆肉汤内有时液体澄清,菌量多时呈混浊生长,血平板上菌落呈金黄色,有时也为白色,大而突起、圆形、不透明、表面光滑,周围有溶血圈。在Baird一Parker平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径为2mm——3mm,颜色呈灰色到黑色,边缘为淡色,周围为一混浊带,在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度,偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落;但无混浊带及透明图。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些,外观可能粗糙并干燥。


(5)血浆凝固酶试验:吸取1:4新鲜兔血浆0.5mL,放入小试管中,再加人培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤堵养物0.5mL,振荡摇匀,置36℃士1℃温箱或水浴内,每半小时观察一次,观察6h,如呈现凝固,即将试管倾斜或倒置时,呈现凝块者,被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。


2、直接计数方法6.2.1吸取上述1:10混悬液,进行10倍递次稀释,根据样品污染情况,选择不同浓度的稀释液1mL,分别加人三块Baird一Parker平板,每个平板接种量分别为0.3mL、0.3mL、0.4mL,然后用灭菌L棒涂布整个平板。如水分多不易吸收,可将平板放在36℃士1℃ lh,等水分蒸发后反转平皿置36℃士1℃培养。


在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落,并从中任选五个菌落,分别接种血平板,36℃士1℃ 24h培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验,步骤同增菌培养法。


3、菌落计数:将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加,乘以血浆凝固酶阳性数,除以5,再乘以稀释倍数,即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。   

 
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